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多能干細胞(ES/iPS)凍存和復蘇方法
2019.05.05   點擊229次

多能干細胞(ES/iPS)凍存是干細胞擴增傳代過程中重要的一環,但是多能干細胞不同于普通細胞系,其增殖擴增過程中需要聚團生長,為保持其細胞活性,不建議單細胞傳代。而且使用血清+DMSO凍存方法,不能很好的保持細胞活性,且復蘇細胞成活率較低。本文就重點介紹多能干細胞進行凍存以及解凍的標準化步驟。

介紹使用AppliedCell™ 多能干細胞培養基以及Advance多能干細胞培養基培養的細胞,

本方法適用于AppliedCell™ 多能干細胞培養基以及Advance多能干細胞培養基培養的細胞(同樣適用于mTesR以及E8系統培養的細胞),凍存以及復蘇前后,應當使用同一種培養基,復蘇傳代后可以更換其他培養體系。

erum-Free干細胞凍存液(AC-1001011/12)是埃澤思生物專為ES/iPS  細胞設計的的一款化學成分確定,無血清,無動物源成分,且無需程序降溫的高效凍存液。具體凍存及復蘇操作方法如下:

1、凍存:以下操作方法以6孔板為例:

(1) Serum-Free干細胞凍存液為即拿即用,且4℃保存,凍存液拿出后應快速放回4℃;

(2)使用多能干細胞消化液(AC-1001008)消化細胞;

(3)收集細胞,室溫300×g離心5分鐘;

(4)小心吸掉上清液,不要干擾細胞團;

(5)用1ml凍存液重懸細胞,并均勻分裝到凍存管中

采用非程序降溫法,將凍存管直接放入-80℃冰箱中,凍存24h后轉移至液氮中長期保存。

2、解凍

預先包被細胞培養板,人ES和iPS細胞解凍后應立即接種到培養板中。

(1)多能干細胞培養基/Advance 多能干細胞培養基室溫平衡15-30min,不能37℃加熱;

(2)在水浴鍋中持續晃動凍存管,37℃水浴鍋中快速解凍細胞,直至細胞完全融化;

(3)取出凍存管,用70%乙醇擦拭凍存管表面;

(4)準備15mL離心管,預先加入5mL多能干細胞培養基,將細胞懸浮液緩慢逐滴至15mL離心管中,盡量保持細胞聚團狀態。

(5)在室溫300×g離心5分鐘。

(6)吸掉上清,注意不要干擾細胞沉淀。使用1mL多能干細胞培養基輕輕地重懸細胞3-5次,不要破壞細胞聚團狀態。

(7)分別取0.5mL細胞懸液,均勻接種到包被好的6孔板的2個孔中,并分別補充多能干細胞培養基至2m。

(8)置于37°C細胞培養箱中。在前后左右呈十字形搖動培養板板5次,以均勻分散細胞。

(9)每天更換培養基,并顯微鏡下觀察細胞狀。 

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